Taq SYBR® Green qPCR Premix (通用型)

產(chǎn)品貨號(hào)：R0202

儲(chǔ)存條件：長期保存請于 -20℃避光保存，Mix 融解后可在 4℃避光條件下穩(wěn)定存放一個(gè)月，盡量避免反復(fù)凍融。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型產(chǎn)品簡介

Taq SYBR® Green qPCR Premix 是 SYBR® Green I 嵌合染料法專用qPCR試劑，為2×預(yù)混液，包含除引物和DNA樣品以外的所有qPCR組分，可減少操作步驟，縮短加樣時(shí)間，降低污染幾率。其核心組分是經(jīng)抗體修飾的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，配合精心優(yōu)化的Buffer體系以及PCR反應(yīng)促進(jìn)因子，使產(chǎn)品具有特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等特點(diǎn)，有效抑制非特異性擴(kuò)增，可對寬廣濃度范圍的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，獲得穩(wěn)定可靠的qPCR結(jié)果。

2x Realab Green PCR Fast mixture通用型使用方法：

1.適配機(jī)型

全機(jī)型通用

2.使用注意

① 因Mix中預(yù)混有染料，其保存或反應(yīng)體系配制過程應(yīng)避免強(qiáng)光照射；

② 使用前上下顛倒輕輕混勻Mix，請勿渦旋振蕩混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡。

3.建議的qPCR反應(yīng)體系

a.調(diào)通推薦的引物終濃度為0.2uM，反應(yīng)效果不佳時(shí)可在0.1~1uM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整;

b.推過薦模板加樣量的為1~2ul，如模板類型為未稀釋cDNA原液，模板添加量不應(yīng)超過總反應(yīng)體系的10%，不同種類DNA模板中含有的靶基因拷貝數(shù)目不同，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，以確定必要的DNA模板添加量。

4.qPCR 反應(yīng)程序（可根據(jù)機(jī)型適當(dāng)調(diào)整）

兩步法：

三步法：

a.根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定；若擴(kuò)增片段在200bp以內(nèi)，退火&延伸（延伸）時(shí)間可以設(shè)置為15sec;此外，退火&延伸（延伸）時(shí)間的設(shè)置還需根據(jù)您使用的qPCR儀所需的最短數(shù)據(jù)采集時(shí)間自行調(diào)整；

b.不同 qPCR 儀的熔解曲線采集程序有差別，一般可使用儀器默認(rèn)的熔解曲線采集程序。

5.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

若使用默認(rèn)反應(yīng)條件反應(yīng)性能不佳時(shí)，則需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以從引物濃度以及擴(kuò)增程序兩個(gè)方面進(jìn)行：

① 引物濃度調(diào)整

當(dāng)引物終濃度在0.1~1.0uM范圍之間變化時(shí)，引物濃度越低，擴(kuò)增特異性越高，但擴(kuò)增效率會(huì)有所下降。

② 擴(kuò)增程序優(yōu)化

需提高擴(kuò)增特異性，可使用兩步法程序或提高退火溫度；需提高擴(kuò)增效率，可使用三步法程序或延長延伸時(shí)間。

6.引物設(shè)計(jì)原則

① 擴(kuò)增產(chǎn)物長度建議控制在80~200bp；

② 引物長度為18~25bp；

③ 正向引物和反向引物的Tm值相差不超過 1℃為佳，Tm值控制在58~62℃為佳；

④ 引物的GC含量控制在 40%~60% 之間；

⑤ 引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避開T/C或者A/G的連續(xù)結(jié)構(gòu)（特別是3'端）；

⑥ 引物3'端zuihou一個(gè)堿基zuihao為G或者C；

⑦ 避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間的互補(bǔ)序列；

⑧ 使用NCBI BLAST功能檢索確認(rèn)引物的特異性。